Stofftrennung durch Ausschütteln, Seifen und Gelelektrophorese¶

1. Fülle einen Scheidetrichter ca 6 cm hoch mit Diethylether
2. gib einen gestrichen Mikropolylöffel Alizarin zu und schüttle gut. Vorsicht: entlüften!.
3. Gib etwa gleich viel deionisiertes Wasser zu und schüttle wieder gut. Entlüften nicht vergessen!
4. Gib nun ca 1.0 mL NaOH (3 M) zu und schüttle wieder gut.
5. Hole das Alizarin wieder in die Diethylether-Phase zurück.
6. Trenne die Phasen und gewinne das Alizarin wieder aus der Diethyletherphase (Rotoavap)

B.1¶

Auftrag an die SuS: nur mit Hilfe der aufstehenden Lösungen den pKS-Wert der Indikatoren bestimmen.

B.2 Demo-Experiment Chinin¶

• Schweppes oder anderes Chinin-haltiges Getränk wird unter der UV-Lampe betrachtet.
• Wie kriegt man es aus dem zuckrigen Schweppes heraus?
• Im Scheidetrichter Überschichten mit Diethylether und Protonierung verhindern durch Zugabe von etwas Base
• Wässrige und Diethyletherphase trennen.
• Wässrige Phase unter UV-Lampe betrachten: keine Fluoreszenz mehr. Chinin muss in der Diethyletherphase sein! Ist allerdings etwas gemogelt: das deprotonierte Chinin fluoresziert nicht!
• Im Scheidetrichter: Unterschichten der Dietyhletherphase mit HCl 0.01 M und Ausschütteln
• Phasen trennen
• Unter UV fluoresziert nun wieder Chinin in der wässrigen Phase.

B.3 Untersuchung¶

• Welche Farbe hat Alizarin bei verschiedenen pH-Werten

B.3. Auftrennung und mit Einengen im Rotavap¶

• Alizarin in Wasser lösen und im Scheidetrichter in Diethyletherphase holen (Versetzen des Alizarins mit etwas NaOH conc)
• Alizarin wieder in die wässrige Phase holen
• wieder in die Dietyheltherphase
• Phasen trennen und Diethyhletherphase im Rotavap einengen.

Vakuolen¶

Zitronensaft ist so sauer, dass er viele gewöhnliche Proteine sofort zerstört (daher flockt Milch beim Zutropfen von Zitronensaft aus). Ist es überhaupt möglich, dass Zitronen leben und wachsen können? Ganz einfach: Die saure Lösung ist sicher in der Vakuole verpackt, während der Rest der Zelle einen neutralen pH aufweist. Isst man eine Zitrone, platzen die Vakuolen auf und man bekommt die saure Lösung ab. Die Hydroxonium-Ionen (H3O+) sind wegen ihrer Ladung so hydrophil, dass sie nicht durch die Vakuolen-Membran (Tonoplast) hindurch entweichen können. Dieses Beispiel zeigt zwei wichtige Dinge über Pflanzenzellen: Vakuolen sind sauer (typischerweise pH 5-5.5), wenn auch nicht immer so sauer wie in Zitronen (pH 2.5). Und Stoffe, die für die Pflanze selber toxisch sind, werden meist in einer sehr hydrophilen Form in der Vakuole sicher aufbewahrt. Aber dazu später mehr.

Neutralrot¶

1. Wo treten in folgender Skelettformel von Neutralrot die nEPs (nichtbindende Elektronenpaare) auf?

1. Neutralrot ist zwar wasserlöslich, aber nicht sehr gut. Warum?

2. Im Handel ist aber eine ausgezeichnet wasserlösliche „Neutralrot-Variante“ käuflich. Auf welche Weise wird dabei Neutralrot löslich gemacht?

1. Neutralrot kann nur an den zwei zentralen N-Atomen gut protoniert werden, nicht aber an den Amin- und Dimethyl-Amin-Gruppen links und rechts unten im Molekül. Versuche diesen Sachverhalt zu erklären anhand von

a. Grenzformeln b. Einer Darstellung des Moleküls im Ladungswolkenmodell (nur π-Bindungen und nEPs als Ladungswolken darstellen). c. Neutralrot ist bei tiefem pH kirschrot, bei hohem orange. Warum ist es einleuchtend, dass die Neutralrot-spezies unterschiedliche Farben haben, aber dass sich diese Farben nur relativ wenig unterscheiden?

Ion trapping mit Neutralrot¶

Der pK_S-Wert für Neutralrot ist etwa 7. Man findet in der Literatur leicht unterschiedliche Werte, da er von den Bedingungen abhängt (z.B. Temperatur, Ionengehalt). Verwende für diese Aufgabe den pK_S = 7.0.

1. Ergänze im nachstehenden Diagramm eine Skala für den pOH und zeichne die Pufferkurve für Neutralrot (HNeuR+/NeuR).

1. Behandelt man Pflanzenmaterial mit neutralen oder leicht basischen Neutralrot-Lösungen, so stellt man fest, dass sich das Neutralrot recht spezifisch in den Vakuolen ansammelt. Vakuolen weisen typische pH-Werte zwischen pH 5.5 (Rose) und 2.5 (Zitrone) auf. i) Welche Neutralrotspezies schafft es wohl, die Zellmembran zu durchdringen?

ii) Betrachten wir nun nur diese Spezies. Die Geschwindigkeit, mit der diese Spezies die Membran durchdringt, hängt davon ab, wie gross ihre Konzentration ist, wie oft die entsprechenden Teilchen also auf die Membran prasseln. Angenommen, die Konzentration dieser Spezies sei in der Vakuole c0. Wie gross muss dann im Gleichgewicht die Konzentration dieser Spezies ausserhalb der Zelle sein?

iii) Wie viel mal mehr Neutralrot enthält eine Vakuole (pH 5) als die neutrale Umgebung (pH 7) im Gleichgewicht?

Stoffe, die wie Neutralrot in einer elektrisch ungeladenen Form Membranen durchdringen können, sammeln sich in denjenigen Kompartimenten an, in denen sie zu hohen Anteilen ionisch vorliegen. Sie werden also ionische Spezies gefangen. Daher spricht man in diesem Zusammenhang von Iontrapping oder Ionenfallen.

iv) Würde sich das Neutralrot ebenfalls im Inneren der Vakuolen ansammeln, wenn es den pKs 2 aufweisen würde?

Vitalfärbungen mit Neutralrot¶

Neutralrot ist ein beliebter Farbstoff für Vitalfärbungen, da es sich passiv (durch Diffusion) in den Vakuolen anreichert, ohne die Zellen zu zerstören (siehe unten). Die Energie für diese Anreicherung stammt aus dem pH-Unterschied zwischen Cytosol und Vakuoleninnerem. Dieser pH-Gradient wird von den Pflanzen aktiv aufrecht erhalten, stirbt eine Zelle ab, so gleicht sich der pH-Wert schnell aus und das Neutralrot wird nicht mehr angereichert.

Experimente mit Neutralrot¶

1. Verdünne die Neutralrot-Stammlösung (0.10 g Neutralrot in 100 mL dH2O) vor Gebrauch mit Leitungswasser (leicht basisch) ca. 1:5 bis 1:10 (=„Neutralrot-Farblösung“)
2. Gib in zwei RG je ca. 1-2 mL Neutralrot-Farblösung und überschichte die beiden Lösungen mit 1-2 mL Hexan. Versuche nun, mit Hilfe einzelner Tropfen von Salzsäure oder Natronlauge (1M), das Neutralrot möglichst weitgehend in die wässrige bzw. hydrophobe Phase zu bringen.
3. Die innere Zwiebelschuppenepidermis einer Küchenzwiebel wird abgezogen. Die Epidermisstückchen werden in einem Tropfen Neutralrot-Farblösung auf einen Objektträger gebracht. Nach 10 bis 20 Minuten zeigt sich unter dem Mikroskop eine deutliche Anreicherung des Farbstoffes in den Vakuolen der immer noch lebenden Zellen, besonders am Rand der Probe.
4. Sauge eine Kaliumthiocyanat-Lösung (1 mol/L, 9.7g / 100mL) durch. Was beobachtet man und wie ist die Beobachtung zu verstehen? Sind die Vakuolen- und Zellmembran der beobachteten Zellen intakt?
5. Lege das Präparat für einen späteren Versuch zur Seite und wiederhole den Versuch mit einer Farblösung, bei der die Neutralrot-Stammlösung 1:5 bis 1:10 in deionisiertem Wasser statt Leitungswasser verdünnt ist.
6. Sauge nun stark verdünnte Ammoniaklösung (0.1%) unter dem Deckglas des ersten Präparats durch. Wie lassen sich die Beobachtungen erklären?

Auch tierische Zellen können Neutralrot akkumulieren, und zwar in den Lysosomen. Lysosomen sind von einer einfachen Membran umschlossene Vesikel mit vielen Enzymen für den Abbau von Makromolekülen. Diese Enzyme funktionieren nur in saurem Milieu, und so weisen Lysosomen typsischerweise einen pH von 4.5 – 5 auf. Dies schützt die Zelle beim Platzen eines Lysosoms: die Enzyme werden durch den neutralen pH im Cytosol sofort inaktiviert.

Nur lebende Zellen können Neutralrot in ihren Vakuolen oder Lysosomen akkumulieren (weshalb?). Somit kann Neutralrot als Zytotoxizitätstest eingesetzt werden: Die Aufnahmefähigkeit von Neutralrot kann als Mass dafür verwendet werden, wie viele Zellen noch lebend sind. Teste damit die Frische von Gemüse oder von einem Stück Fleisch.

Hinweise

Zu 2: Der Versuch zeigt, dass auch die ungeladene Form von Neutralrot nicht allzu hydrophob ist: Neutralrot fällt in basischer Lösung nicht aus und nur ein kleiner Teil wechselt die Phase ins Hexan. Immerhin: Neutralrot wechselt nur im Gleichgewicht mit basischer Lösung in die Hexan-Phase, wenn es protoniert und elektrisch geladen ist, bleibt es zu 100% in der wässrigen Lösung. Dieser Versuch erklärt auch, weshalb Neutralrot die Membran nur passiert und nicht ganz darin hängenbleibt und die Membran dadurch zerstört.

Zu 4: Mit Durchsaugen einer Kaliumthiocyanat-Lösung (1 mol/L, 9.7g / 100mL) können die Zellen leicht plasmolysiert werden (d.h. der Protoplast schrumpft). Offenbar sind die Zellmembranen noch intakt.

Zu 5: Wenn die Neutralrot-Lösung leicht sauer ist, unterbleibt die Anreicherung. Statt der Vakuolen färben sich nun die Mittellamellen der Zellwände, denn diese bestehen aus dem Makro-Polyanion Polygalakturonsäure, die den geladenen Farbstoff als Gegenion (adsorptiv) bindet (vermutlich nur bei tiefer Ionenkonzentration im Medium!).

Zu 6: Saugt man stark verdünnte Ammoniaklösung (0.1%) unter dem Deckglas durch, so entfärben sich die Vakuolen: Ammoniak-Moleküle gelangen genau wie das Neutralrot in die Ionenfalle der sauren Vakuolen, aber die Konzentration des Ammoniak steigt so lange, bis der pH der Vakuolen weit über den pKS-Wert des Neutralrots steigt und die Ionenfalls für Neutralrot nicht mehr funktioniert (Ammoniak hat einen deutlich höheren pKS von über 9.).

Die Haut hat normalerweise einen pH von rund 5.5 (Säureschutzfilm, gegen das Wachstum von Bakterin und Pilzen). Blut und Lymphe (Interstizialflüssigkeit) weisen pH-Werte von rund 7.4 bzw. 7 auf.

Nitrazingelb ist bei tiefem pH gelb und schlägt zwischen pH 6 und pH 7 nach dunkelblau um. Dort, so das Nitrazingelb dunkelblau wird, wird der pH durch nach aussen dringende Körperflüssigkeit (Lymphe) bestimmt. An diesen Stellen ist man nicht ganz dicht.

In der Hautkosmetik testet man mit Nitratzingelb, ob Crèmes die Haut heilen lassen.

Lösung auf die Haut pinseln oder mit Watte auftragen. Besonder auf der Finger-Oberseite und um die Fingernägel ist der pH oftmals hoch.

Simulation Grotthuss-Mechanismus

Herstellung der Puffer¶

Pufferlösung pH 5.5 und pH 2.2 (Phthalat-Puffer)¶

Stelle 200 mL eines Puffers her, welcher den pH 5.5 aufweist und 0.1 mol/L Phthalat-Spezies enthält

Rechts sind die Pufferkurven dieser Spezies zu sehen.

Der Puffer pH 5.5 wird hergestellt, indem zu der Kaliumhydrogenphthalat-Lösung die entsprechende Menge NaOH (1 M oder 0.1 M) zugegeben wird.

• Löse die ensprechende Menge Kaliumhydrogenphthalat (M= 204.22 g/mol) in etwa 100 mL Wasser und miss den pH. War der gemessene Wert zu erwarten? Für ein Gel mit gefüllter Gelkammer sind 200 mL Puffer nötig (Laufpuffer wird nochmals auf halbe Konzentration verdünnt), also 4.1 g KHPh.
• Ermittle die notwendige Menge an NaOH, z.B. mit den nebenstehenden Pufferkurven
• gib diese Menge zu, überprüfe den pH mit dem pH-Meter und justiere gegebenenfalls mit NaOH oder HCl 0.1M.
• fülle dann in einem Messkolben mit Wasser auf 300mL auf.

Der Puffer pH 2.2 wird auf analoge Weise hergestellt, nur dass der pH mit HCl statt mit NaOH eingestellt wird.

Pufferlösung pH 7.2, 8.0 und 11.5 (Phosphat-Puffer)¶

• Stelle 200 mL eines Puffers für den pH 7.2, pH 8.0 oder pH 11.5 mit Phosphat-Spezies her. Die Konzentration der Phosphat-Spezies im Puffer soll 0.100 mol/L betragen. Zur Verfügung stehen
  • Na₃PO₄ · 12 H₂O (M = 380.12 g mol-1)
  • Na₂HPO₄ · 12 H₂O (M = 358.14 g mol-1)
  • NaH₂PO₄ ·2 H₂O (M = 156.02 g mol-1).
• Berechne, von welcher Phosphat-Spezies (oder zusätzlich NaOH oder HCl) wie viel hinzugefügt werden muss, um den gewünschten pH zu erreichen.
• Stelle den Puffer her. Fülle dabei mit Wasser erst auf ca 100-150 mL auf.
• Miss den pH und stelle ihn gegebenenfalls mit NaOH oder HCl ein
• Fülle die Lösung nun in einem Messkolben mit Wasser auf 200mL auf.

TBE-Puffer („Tris-Borat-EDTA-Puffer“)¶

TBE-Puffer weist etwa pH 8.3 auf.

Pufferlösung pH 9 (Ammonium/Ammoniakpuffer)¶

200 mL Puffer der Konzentration 0.1 M:

• 1.07 g NH4Cl (53.49 g mol-1) einwägen
• pH mit NaOH auf 9 einstellen
• Mit deinonisiertem Wasser auf 200 mL auffüllen.

Gelkammern¶

Pro Gelkammer 300 mL Laufpuffer bereitstellen: den obigen Puffer pH 5.5 mit deionisiertem Wasser auf halbe Konzentration verdünnen (für ein Gel und eine Gelkammer also 150 mL Puffer 150 mL deionisiertem Wasser mischen.

Agarose-Gele¶

• Giessvorrichtung: Den Gelträger aus Plexiglas in eine trockene Gelkammer legen und vorne und hinten mit je einem Metallkeil verschliessen.
• In einem kleinen Erlenmeyer 0.3 g Agarose mit 30 mL Laufpuffer mischen
• Das Gemisch mehrfach kurz (ca. 20 Sekunden) im Mikrowellenofen oder über der Gasflamme erhitzen und schwenken (Vorsicht: Siedeverzug), bis die Agarose gelöst ist.
• Danach die Lösung auf 45°C abkühlen lassen, handwarm in die Giessvorrichtung giessen, den Kamm sogleich in der Mitte der Vorrichtung einsetzen und das Agarosegel erhärten lassen.
• Sobald das Agarosegel hart ist, werden der Kamm und die Keile vorsichtig entfernt. Das Gel wird so positioniert, dass die längere Laufstrecke ausgehend von den Aussparungen im Gel (Slots) in Richtung Pluspol (rot) weist. Die Gelkammer mit so mit Laufpuffer gefüllt, dass Lösung das Gel gerade knapp eindeckt.

Experiment:¶

1. Damit die Proben in die Geltaschen (Slots) sinken, müssen sie vor dem Auftragen mit etwas Glycerin gemischt werden. Zudem muss in den Proben der richtige pH-Wert eingestellt werden. Zu diesem Zweck wird zuerst ein Ladepuffer hergestellt: Glycerin (Propan-1,2,3-triol) wird zu ca. 50% Volumenprozen in Laufpuffer gelöst.
2. Die Farbstoffe werden (zu ca. 50%) mit Ladepuffer gemischt.
3. Von jeder Probe werden 20 μL auftragen. Von schwach gefärbten Proben kann auch mehr aufgetragen werden (Slot ganz füllen).
4. Der Deckel wird aufgesetzt und die Proben werden während 2-10 Minuten bei etwa 300V (pro Gel ca. 50 mA) laufen gelassen. Generell können solche Gele bei maximal 80-100 mA (6-7mA/cm) laufen. Bei zu hohen Strömen erhitzt sich das Gel zu stark, in diesem Fall den Strom bzw. die Spannung senken.

Falls es noch freie Slots gibt

1. Einzelne Kriställchen Kaliumpermanganat (höchstens ein winziges Kriställchen) oder Kupfer(II)-nitrat (möglichst viele Kriställchen) können direkt in ein Slot gegeben werden. Kaliumpermanganat kann Plexiglas schädigen, darf also nicht aus dem Gel entweichen.

Auswertung¶

1. Skizziere das Gel, interpretiere die Resultate
2. Überprüfe den pH des Puffers beim Minus- und Pluspol auf beiden Seiten des Gels. Die pH-Veränderung ergibt sich durch die Vorgänge an den beiden Platindrähten (Elektroden) an den Enden der Gelkammer.
3. Welche Auswirkungen hat die gemessene pH-Veränderung im Prinzip auf Proben wie Neutralrot, 4-Nitrophenol oder Kupfer(II)-Ionen (Verfärbung? Veränderung der Laufgeschwindigkeit?).